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meilunbio双酶报告基因试剂盒横空出世!取代进口填补国内空白,只为真正懂你的人而生!
2019-12-04  来源:美仑生物

 

 

 

 

 

 

填补国内空白
meilunbio双酶报告基因试剂盒

 

 

 

 

 

 

 

产品简介:
报告基因系统广泛应用于真核生物基因表达和细胞生理学研究,包括受体活性、转录因子、细胞信号转导、mRNA加工和蛋白质折叠等。“双报告基因”通常被用来提高实验精确度,即在一个系统中同时表达和测量两个独立的报告基因。一般来说,实验组报告基因与具体实验条件的影响是相关的,而共同转染的内对照组报告基因则是用来充当校正参数,作为内参提供反应基线。将实验组的结果与内对照组的结果进行约化处理,可降低由细胞存活率或转染效率的差异而导致的结果波动,同时还可消除由取样体积、细胞裂解效率和仪器测定引起的实验误差。因此,双报告基因检测可以通过减少外部影响来获得更可靠的实验数据。
美仑双萤光素酶报告基因检测试剂盒(Firefly & Renilla Luciferase Reporter Assay Kit)提供了一种有效的双报告基因检测方法,在同一个样品中先以萤光素(Luciferin)为底物来检测萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase),后以腔肠素(Coelenterazine)为底物来检测海肾萤光素酶(Renilla luciferase),同时淬灭Firefly luciferase的萤光信号,实现双萤光素酶报告基因检测。该试剂盒可灵敏高效的检测受基因元件调控的Luciferase表达,通常将转录调控元件或5'启动子区克隆在Firefly luciferase的上游,或把3'-UTR区克隆在Firefly luciferase的下游,构建成报告基因(reporter gene)质粒。将报告基因质粒(Firefly)和内参质粒(Renilla)共转染细胞,经给药刺激等操作完毕后,裂解细胞并测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性的高低来判断药物处理对目的基因的转录调控作用。Renilla luciferase作为校正转染效率的内参可以消除细胞数量和转染效率的差异。萤火虫萤光素酶催化Luciferin发光的最强发光波长为560nm。海肾萤光素酶催化Coelenterazine发光的最强发光波长为465nm,具体波段选用需依据实验需求和所用仪器进行设定,通常采用全波段接收发射信号即可,不必单独设置。
反应原理如下:

 

 

数据展示


 

 

图1. 萤火虫萤光素酶发光强度、淬灭效果以及海肾萤光素酶发光强度对比。由图可知,各组间Firefly luciferase/ Renilla luciferase浓度和比例相同的前提下,美仑组的发光强度高于国产品牌。更为重要的是,美仑组的Firefly luciferase 淬灭效果最佳,远超国内其他品牌,荧光残留量仅为0.001%!几乎完全不影响Renilla再发光,因而具有最高的Renilla 信噪比,使得测试结果更加准确,数据可重复性提高!而其他国产试剂Firefly萤光淬灭很差,背景很高,直接影响Renilla读值。(仪器:BioTek HTX)

 

 

 

图2. 美仑Firefly luciferase萤光信号稳定性(动力学)检测。从反应初始时刻持续追踪Firefly luciferase萤光信号30s,可以发现美仑组的萤光信号近乎无衰减,信号稳定性极好,远远满足常规机器操作所需时长!(仪器参数:VILBER/化学发光/-90制冷CCD)


 

 

图3. 美仑组Luminescence-Firefly luciferase浓度梯度标准曲线。在仪器(BioTek HTX)允许的最大测试范围内,美仑Firefly luciferase 萤光线性检测范围可达8个数量级,R2可达0.9996!(仪器:BioTek HTX)

 

 

 

TNFa

20ng/ml

10ng/ml

5ng/ml

2ng/ml

0ng/ml

Firefly:Lum

1835882

952348

193674

44991

43038

Renilla:Lum

21336

29067

24360

25063

26178

Firefly/Renilla ratio

86.046

32.763

7.950

1.795

1.644

Firefly/Renilla normalized

52.336

19.928

4。835

1。091

1.000

 

图4. 美仑双萤光素酶报告基因检测试剂盒实际应用举例。HEK-293T细胞共转染了萤火虫萤光素酶NF-κB response reporter 和海肾萤光素酶内参质粒。转染后12h,进行TNFα浓度梯度诱导,5h后收集细胞并进行裂解。酶标仪检测双酶的信号读值,对数据进行约化和归一化处理,详见表格。上图为Firefly/Renilla约化数据折线图,可以明显看出Firefly/Renilla ratio 与给药浓度呈正相关,符合预期,并且梯度间变化显著,提示美仑双萤光素酶报告基因检测试剂盒灵敏度高!(仪器:BioTek HTX)

 

 

 

 

 

 

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